撰文 | 鄭詩(shī)蔚 責(zé)編 | 谷國(guó)燦

　藏靈骨泰功效　神經(jīng)母細(xì)胞瘤是一種起源于交感神經(jīng)系統(tǒng)的胚胎性腫瘤，好發(fā)于2歲以下的嬰幼兒，是兒童期最常見的顱外實(shí)體瘤。神經(jīng)母細(xì)胞瘤具有臨床異質(zhì)性，腫瘤可自發(fā)消退，也可表現(xiàn)為侵襲性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移性播散。根據(jù)其臨床生物學(xué)行為，可以將患者分為低危組、中危組和高危組，從而采取不同的治療手段。患者的預(yù)后與危險(xiǎn)分層相關(guān)，對(duì)于高危組患者，目前5年生存率仍低于40%。

　　腫瘤的發(fā)生發(fā)展依賴于腫瘤微環(huán)境，了解微環(huán)境的構(gòu)成，特別是免疫微環(huán)境的構(gòu)成，對(duì)于神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療可以起到重要的啟示性作用。盡管當(dāng)前神經(jīng)母細(xì)胞瘤免疫微環(huán)境的研究已取得初步進(jìn)展，但對(duì)其細(xì)胞構(gòu)成的認(rèn)識(shí)還不夠全面。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)能夠在單細(xì)胞水平對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測(cè)序分析，在研究腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞構(gòu)成上具有顯著優(yōu)勢(shì)。借助于這一技術(shù)，有望藏靈骨泰正品旗艦店 揭開神經(jīng)母細(xì)胞瘤免疫微環(huán)境的神秘面紗，進(jìn)而有針對(duì)性地對(duì)患者進(jìn)行治療。

　　2022年8月5日，來自法國(guó)居里研究所的Ana Costa, Cécile Thirant, Amira Kramdi等人在Journal for ImmunoTherapy of Cancer雜志上發(fā)表題為Single-cell transcriptomics reveals shared immunosuppressive landscapes of mouse and human neuroblastoma的文章。在這項(xiàng)研究中，研究人員使用單細(xì)胞RNA測(cè)序，分析了小鼠和人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤微環(huán)境成分的轉(zhuǎn)錄組，通過聚類分析揭示了腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的構(gòu)成，并通過流式細(xì)胞技術(shù)和功能實(shí)驗(yàn)對(duì)相關(guān)的免疫細(xì)胞進(jìn)行了驗(yàn)證。該研究為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的研究提供了寶貴的參考資料，并通過描述微環(huán)境的免疫成分為未來提供了可能的治療方向。

　　該研究中使用的神經(jīng)母細(xì)胞瘤小鼠模型為TH-MYCN轉(zhuǎn)基因小鼠，研究人員首先將小鼠腫瘤樣本分解成單細(xì)胞懸液，然后用10x 藏靈骨泰 Genomics平臺(tái)進(jìn)行細(xì)胞分選、用NovaSeq進(jìn)行RNA測(cè)序。在完成單個(gè)樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)控后，對(duì)篩選后的三個(gè)樣本的單細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，共獲得5650個(gè)細(xì)胞，每個(gè)腫瘤樣本平均含有1883個(gè)細(xì)胞。在用Seurat工具做細(xì)胞聚類和細(xì)胞類別標(biāo)記后，研究人員發(fā)現(xiàn)：在小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤的微環(huán)境中，除Phox2b+腫瘤細(xì)胞外，共有八種細(xì)胞類型，包括Cd68+巨噬細(xì)胞，Cd14+髓系細(xì)胞，Cd79a+B細(xì)胞，Cd3e+T細(xì)胞，Irf8+樹突細(xì)胞，Nkg7+NK細(xì)胞，以及Fn1+癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞和vWF+內(nèi)皮細(xì)胞。其中巨噬細(xì)胞和Cd14+髓系細(xì)胞占比最大，這一結(jié)果也被免疫組化以及流式細(xì)胞分析結(jié)果驗(yàn)證。

　　UMAP圖（左）顯示小鼠中單細(xì)胞聚類結(jié)果和微環(huán)境細(xì)胞組成，餅圖顯示不同細(xì)胞成分在微環(huán)境中的占比

　　聚類分析結(jié)果顯示，在小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤的微環(huán)境中存在三種巨噬細(xì)胞群體，根據(jù)其上調(diào)表達(dá)基因的不同，這三種巨噬細(xì)胞被稱作Pecam1+，Ccr2+和Apoe+巨噬細(xì)胞。進(jìn)一步分析顯示，Apoe+巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)和傳統(tǒng)M2巨噬細(xì)胞相似，而另外兩種巨噬細(xì)胞與在其他研究中發(fā)現(xiàn)的巨噬細(xì)胞群體沒有太多相似之處，這一結(jié)果表明不同腫瘤附近的巨噬細(xì)胞具有高度異質(zhì)性。

　　對(duì)于被標(biāo)記為Cd14+的髓系細(xì)胞，研究人員發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞上調(diào)了中性粒細(xì)胞的標(biāo)記基因（S100a8，S100a9，Mmp9），同時(shí)還與多型核中性粒細(xì)胞-髓源抑制性細(xì)胞（PMN-MDSC）的基因表型重合，這一表型提示與免疫抑制相關(guān)。此外，Cd14+的髓系細(xì)胞還上調(diào)與免疫抑制相關(guān)的基因（Il1b，Arg2）。免疫組化和流式細(xì)胞結(jié)果證實(shí)，小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤的微環(huán)境中的確存在PMN-MDSC和M-MDSC（單核細(xì)胞-MDSC）兩種亞型，分別被CD11b+Ly6G+Ly6Clow和CD11b+Ly6G-Ly6Chigh標(biāo)記。

　　隨后，研究人員對(duì)10例神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者（其中初診和復(fù)發(fā)患者各5例，伴或不伴有MYCN基因擴(kuò)增患者各5例）的活檢樣本進(jìn)行分析，這些樣本共包含了20296個(gè)細(xì)胞。除了PHOX2B+、GATA3+腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞外，聚類分析還發(fā)現(xiàn)了CD68+巨噬細(xì)胞（包含四個(gè)亞型），CD3D+T細(xì)胞，NKG7+NK細(xì)胞，MS4A1+B細(xì)胞，CD1C+樹突細(xì)胞，CD14+髓系細(xì)胞，CD14int+ 藏靈骨泰多少錢一瓶FCGR3A+非傳統(tǒng)髓系細(xì)胞，以及S100A8+ S100A9+ FCGR3B+髓源抑制性細(xì)胞（MDSC），其中MDSC細(xì)胞同時(shí)還上調(diào)了中性粒細(xì)胞以及PMN-MDSC的標(biāo)記基因。

　　和小鼠的分析結(jié)果相近的是，CD68+ APOE+巨噬細(xì)胞同樣與M2巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)相似，且不同巨噬細(xì)胞亞型之間存在非常顯著的基因表達(dá)差異。運(yùn)用scVelo工具對(duì)巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化軌跡進(jìn)行分析后，研究人員還發(fā)現(xiàn)，APOE+CSF1Rmed與APOE+CSF1Rlow均來自于APOE+CSF1R+巨噬細(xì)胞。而對(duì)于MDSC細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示這種細(xì)胞的占比在伴有MYCN基因擴(kuò)增和復(fù)發(fā)病例中的比例更高，說明MDSC可能與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的復(fù)發(fā)和晚期疾病相關(guān)。

　　UMAP圖顯示神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者樣本中單細(xì)胞聚類結(jié)果和微環(huán)境細(xì)胞組成

　　在獲取了小鼠模型和神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者樣本的分析結(jié)果后，研究人員接下來對(duì)兩個(gè)物種的數(shù)據(jù)進(jìn)行了更詳細(xì)的對(duì)比。結(jié)果顯示小鼠和人的多種細(xì)胞存在基因表達(dá)的極大重合，甚至包括MDSC細(xì)胞，但兩個(gè)物種的巨噬細(xì)胞的亞型關(guān)系則更復(fù)雜，說明巨噬細(xì)胞可能存在與物種相關(guān)的特定基因表達(dá)模式。此外，由于患者中腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞普遍上調(diào)了免疫抑制受體（包括LAG3，TIGIT，CTLA4，HAVCR2/TIM3和PDCD1/PD-L1）的表達(dá)，研究人員推測(cè)MDSC的存在可能是造成T細(xì)胞活性抑制的原因。為了驗(yàn)證這一猜想，研究人員將從野生型小鼠中提取并激活的T細(xì)胞與從神經(jīng)母細(xì)胞瘤模型小鼠中提取的PMN-MDSC（CD45+CD11b+Ly6G+Ly6Clow）藏靈骨泰品質(zhì)保證或M-MDSC（CD45+CD11b+Ly6G-Ly6Chigh ）細(xì)胞一同孵化，發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的增殖被顯著抑制。這證實(shí)了MDSC對(duì)T細(xì)胞的抑制作用，同時(shí)提示了在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的人類樣本中，MDSC細(xì)胞可能會(huì)發(fā)揮相似的功能。

　　小鼠模型中PMN-MDSC和M-MDSC抑制T細(xì)胞增殖的功能驗(yàn)證

　　總的來說，這一研究運(yùn)用單細(xì)胞RNA測(cè)序，結(jié)合免疫組化、流式細(xì)胞以及功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，對(duì)小鼠和人的神經(jīng)母細(xì)胞瘤微環(huán)境組成做了非常詳盡的分析。由于研究人員并未像傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)一樣，對(duì)RNA測(cè)序的樣本進(jìn)行事先篩選，聚類分析的結(jié)果代表了所有腫瘤微環(huán)境中可能存在的細(xì)胞類型，并能精確還原不同細(xì)胞在微環(huán)境中所占的比例。通過對(duì)不同細(xì)胞基因表達(dá)的描述，以及對(duì)巨噬細(xì)胞和MDSC細(xì)胞功能的著重特寫，這項(xiàng)研究為將來神經(jīng)母細(xì)胞瘤的針對(duì)性治療提供了新的方向。

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